Justeringer af nogen af komponenterne i en reaktion med polymerase kædereaktion (PCR) kan ændre udfaldets kvalitet enten ved at forbedre eller mindske produktudbyttet og kvaliteten eller ved at forbedre reaktionsspecificiteten og følsomheden. Parametre, der påvirker slutresultatet, kan enten være fysiske (dvs. temperatur, cykeltider) eller kemiske (dvs. skabelon koncentration, type enzym anvendt). Følgende er flere nøglefaktorer, der påvirker succesen af PCR.
01 Rense laboratoriebetingelser
Da PCR er i stand til at detektere et enkelt DNA-molekyle, er det vigtigt at opretholde uberørte betingelser i laboratoriet. Brug altid friske handsker, brug sterile glasvarer, rør og pipetter og sterile løsninger, og rengør arbejdsområdet inden arbejdet påbegyndes.
Indsæt altid kontrolreaktioner uden template DNA og uden enzym for at sikre, at resultaterne virkelig skyldes forstærkning af den rigtige prøve.
De fleste mennesker sørger for at have deres eget sæt af løsninger, der ikke deles for at gøre fejlfinding nemmere, og udpegede pipetter er ofte afsat til PCR. DNase- og RNase-fri PCR-rør, aerosol-resistente pipettespidser og arbejde i en gasplade med UV-lys er også måder at minimere problemer på.
02 kemiske komponenter
- Har 18 til 24 baser
- Har ingen sekundær struktur (dvs. hårnålsløjfer)
- Har afbalanceret distribution af G / C og A / T par
- Er ikke komplementære til hinanden ved 3-fods enderne
- Har smeltetemperaturer (Tm) ca. 5-10 grader Celcius under glødningstemperaturen, som normalt ligger mellem 55 og 65 grader Celcius
Tm for begge primere skal også være ens for de bedste resultater.
03 Reaktionsblanding: Skabelon og Primers
Optimale primerkoncentrationer er mellem 0,1 og 0,6 mikromol / L. Mængden af skabelon varierer afhængigt af typen af DNA (human, bakteriel, plasmid).
Med meget lave mængder skabelon er der andre strategier til forbedring af resultater, som forøgede cyklusnumre eller brug af "hot start". Test altid nye primere med en positiv kontrolreaktion for at være sikker på at de virker under dine specifikke eksperimentelle forhold.
04 Reaktionsblanding: Enzymaktivitet
Koncentrationen af MgCl2 i reaktionsblandingen kan påvirke PCR-resultatet og kunne spille en vigtig rolle i mere hurtige reaktioner. Magnesiumkation danner opløselige komplekser med dNTP'er for at fremstille det egentlige substrat, som polymeraseenzymet genkender.
Lige mængder af alle fire dNTP'er bidrager også til at reducere polymerasefrekvensen. Visse tilsætningsstoffer, såsom betain, BSA, detergenter, DMSO, glycerol og pyrophosphatase kan også påvirke enzymspecificitet eller reaktionseffektivitet.
05 Type af termocykler
Når du køber laboratorieudstyr, skal du huske på, at nogle termocyklere er mindre præcise end andre ved at opretholde nøjagtige, ønskede temperaturer.
Dette er et område, hvor det går billigt, vil ikke betale sig i det lange løb, når du står over for en finicky reaktion eller ved brug af primere, der kræver et smalt område af glødningstemperatur.
Tyndvæggede reaktionsglas designet til at passe til det præcise mærke af termocykler, du bruger, hjælper også med at optimere reaktionstemperaturerne.
06 Cyklusindstillinger
Øget udbytte kan opnås ved at øge forlængelsestiden omkring hver 20 cyklus for at kompensere for mindre enzym for at forstærke mere skabelon. Normalt er mindre end 40 cyklusser tilstrækkelige til at amplificere mindre end 10 template-molekyler til en koncentration, der er stor nok til at se på et ethidiumbromidfarvet agarosegel .