Genkloning er en handling om at lave kopier eller kloner af et enkelt gen. Når et gen er identificeret, kan kloner anvendes i mange områder inden for biomedicinsk og industriel forskning. Geneteknik er processen med kloning af gener i nye organismer eller ændring af DNA-sekvensen for at ændre proteinproduktet. Geneteknik afhænger af vores evne til at udføre følgende vigtige procedurer.
01 Polymerase Chain Reaction
02 Restriktionsenzymer
Opdagelsen af enzymer kendt som restriktionsendonukleaser har været essentiel for proteinteknik . Disse enzymer skærer DNA på specifikke steder baseret på nukleotidsekvensen. Hundredvis af forskellige restriktionsenzymer , der er i stand til at skære DNA på et særskilt sted, er blevet isoleret fra mange forskellige bakteriestammer. DNA-skåret med et restriktionsenzym producerer mange mindre fragmenter af forskellig størrelse. Disse kan separeres ved anvendelse af gelelektroforese eller kromatografi.
03 elektroforese
Oprensning af DNA fra en cellekultur eller skæring af det ved hjælp af restriktionsenzymer ville ikke være til stor nytte, hvis vi ikke kunne visualisere DNA'et - det vil sige finde en måde at se om din ekstrakt indeholder noget eller hvilken størrelse fragmenterer dig har klippet det ind En måde at gøre dette på er ved gelelektroforese. Geler bruges til en række formål, fra visning af skåret DNA til påvisning af DNA-indsatser og knockouts.
04 Tilmeld dig to stykker af DNA
I genetisk forskning er det ofte nødvendigt at forbinde to eller flere individuelle tråde af DNA, for at skabe en rekombinant streng eller lukke en cirkulær streng, der er blevet skåret med restriktionsenzymer. Enzymer kaldet DNA ligaser kan danne kovalente bindinger mellem nukleotidkæder. Enzymerne DNA-polymerase I og polynukleotidkinase er også vigtige ved denne fremgangsmåde til udfyldning af huller eller phosphorylering af henholdsvis 5'-enderne.
05 Valg af lille selvreplikerende DNA
Små cirkulære stykker af DNA, der ikke er en del af et bakteriegenom, men som er i stand til selvreplikation, er kendt som plasmider. Plasmider anvendes ofte som vektorer til at transportere gener mellem mikroorganismer. I bioteknologi, når først genet er blevet amplificeret, og både genet og plasmidet skæres af restriktionsenzymer, ligeres de sammen, hvilket genererer det, der er kendt som et rekombinant DNA. Viral (bakteriofag) DNA kan også anvendes som en vektor, ligesom cosmider, rekombinante plasmider indeholdende bakteriofaggener.
06 Metode til at flytte en vektor til en værtscelle
Fremgangsmåden til overførsel af genetisk materiale på en vektor, såsom et plasmid, ind i nye værtsceller, kaldes transformation. Denne teknik kræver, at værtscellerne udsættes for en miljøændring, der gør dem "kompetente" eller midlertidigt permeable til vektoren. Elektroporation er en sådan teknik. Jo større plasmidet er, desto lavere er effektiviteten, hvormed det optages af celler. Større DNA-segmenter klones lettere under anvendelse af bakteriofag, retrovirus eller andre virale vektorer eller kosmider i en metode, der kaldes transduktion. Fag- eller virale vektorer anvendes ofte i regenerativ medicin, men kan forårsage insertion af DNA i dele af vores kromosomer, hvor vi ikke ønsker det, forårsager komplikationer og endda kræft.
07 Metoder til at vælge transgene organer
Ikke alle celler vil optage DNA under transformation. Det er vigtigt, at der findes en metode til at opdage de der gør. Plasmider bærer generelt gener for antibiotikaresistens, og transgene celler kan vælges baseret på ekspression af disse gener og deres evne til at vokse på medier indeholdende det antibiotikum. Alternative valgmetoder afhænger af tilstedeværelsen af andre reporterproteiner, såsom x-gal / lacZ- systemet eller grønt fluorescensprotein, hvilket tillader udvælgelse baseret på henholdsvis farve og fluorescens.