Hvad PCR har at gøre med DNA-sekventering og forstærkende gener
Polymerasekædereaktionen ( PCR ) er en molekylærgenetisk teknik til fremstilling af flere kopier af et gen og er også en del af gensekvenseringsprocessen.
Hvordan virker polymerase kædereaktion?
Genkopier fremstilles ved hjælp af en stikprøve af DNA, og teknologien er god nok til at lave flere kopier fra en enkelt kopi af genet, som findes i prøven. PCR-amplifikation af et gen til fremstilling af millioner af kopier, muliggør detektion og identifikation af gensekvenser ved anvendelse af visuelle teknikker baseret på størrelse og ladning (+ eller -) af stykket DNA.
Under kontrollerede betingelser genereres små segmenter af DNA af enzymer, der er kendt som DNA-polymeraser, der tilføjer gratis deoxynukleotider (dNTP'er) til et stykke DNA kendt som "skabelonen". Endnu mindre stykker af DNA, der kaldes "primere", anvendes som udgangspunkt for polymerasen. Primers er små menneskeskabte stykker af DNA (oligomerer), normalt mellem 15 og 30 nukleotider lange. De fremstilles ved at kende eller gætte korte DNA-sekvenser ved selve enderne af genet, der amplificeres. Under PCR opvarmes DNA'et, som sekventeres, og de dobbelte tråde adskilles. Ved afkøling binder primrene til skabelonen (kaldet annealing) og skaber et sted for polymerasen at begynde.
PCR-teknikken
Polymerasekædereaktionen (PCR) blev gjort mulig ved opdagelsen af termofiler og termofile polymeraseenzymer (enzymer, der opretholder strukturel integritet og funktionalitet efter opvarmning ved høje temperaturer).
Trinnene involveret i PCR-teknikken er som følger:
- En blanding skabes med optimerede koncentrationer af DNA-skabelonen, polymeraseenzym, primere og dNTP'er. Evnen til at opvarme blandingen uden denaturering af enzymet muliggør denaturering af dobbelt-helixen af DNA-prøve ved temperaturer i intervallet 94 grader Celsius.
- Efter denaturering afkøles prøven til et mere moderat område, omkring 54 grader, hvilket letter primernes annealing (binding) til de enkeltstrengede DNA-skabeloner.
- I cyklusens tredje trin genopvarmes prøven til 72 grader, den ideelle temperatur for Taq DNA Polymerase til forlængelse. Under forlængelse anvender DNA-polymerase den oprindelige enkeltstreng af DNA som en skabelon for at tilsætte komplementære dNTP'er til 3'-enderne af hver primer og generere en sektion af dobbeltstrenget DNA i området af det gen, der er af interesse.
- Primers, der har annealed til DNA-sekvenser, der ikke er en præcis match, forbliver ikke annealed ved 72 grader, hvilket begrænser forlængelse af genet af interesse.
Denne proces med denaturering, glødning og forlængelse gentages flere (30-40) gange, hvorved eksponentielt antallet af kopier af det ønskede gen i blandingen øges. Selvom denne proces ville være temmelig kedelig, hvis den blev udført manuelt, kan prøver fremstilles og inkuberes i en programmerbar termocykler, der nu er almindelig i de fleste molekylære laboratorier, og en fuldstændig PCR-reaktion kan udføres i 3-4 timer.
Hvert detatureringstrin stopper forlængelsesprocessen for den foregående cyklus, således at den nye DNA-streng trunceres og holdes til ca. størrelsen af det ønskede gen.
Varigheden af forlængelsescyklusen kan gøres længere eller kortere afhængigt af størrelsen af genet af interesse, men i sidste ende gennem gentagne cykler af PCR vil størstedelen af skabeloner være begrænset til størrelsen af det gen, der er af interesse alene, da de vil være blevet genereret af produkter fra begge primere.
Der er flere forskellige faktorer for vellykket PCR, der kan manipuleres for at forbedre resultaterne. Den mest anvendte metode til at teste for tilstedeværelsen af PCR-produkt er agarosegelelektroforese . Hvilket bruges til at adskille DNA-fragmenter baseret på størrelse og ladning. Fragmenterne visualiseres derefter under anvendelse af farvestoffer eller radioisotoper.
Evolutionen
Siden opdagelsen af PCR er andre DNA-polymeraser end den oprindelige Taq blevet opdaget. Nogle af disse har bedre "korrekturlæsning" evne eller er mere stabile ved højere temperaturer, hvilket forbedrer specificiteten af PCR og reducerer fejl fra indsættelsen af den forkerte dNTP.
Nogle variationer af PCR er designet til specifikke applikationer og bruges nu regelmæssigt i molekylære genetiske laboratorier. Nogle af disse er Real-Time PCR og Reverse-Transcriptase PCR. Opdagelsen af PCR har også medført udvikling af DNA-sekventering, DNA-fingeraftryk og andre molekylære teknikker.