DNA-sekventering er også afhængig af vores evne til at anvende gelelektroforese til at adskille DNA-strenge, der afviger i størrelse med så lidt som et basepar.
DNA-sekventering
I slutningen af 1970'erne blev to DNA-sekventeringsteknikker for længere DNA-molekyler opfundet. Disse var Sanger (eller dideoxy) metoden og Maxam-Gilbert (kemisk spaltning) metode. Maxam-Gilbert-metoden er baseret på nukleotidspecifik spaltning med kemikalier og anvendes bedst til at sekvensere oligonukleotider (korte nukleotidpolymerer, sædvanligvis mindre end 50 basepar i længden). Sanger-metoden er mere almindeligt anvendt, fordi det er blevet påvist teknisk nemmere at anvende, og med fremkomsten af PCR og automatisering af teknikken er det let at anvende på lange tråde af DNA, herunder nogle hele gener. Denne teknik er baseret på kædeafslutning af dideoxynukleotider under PCR-forlængelsesreaktioner.
Sanger Metode
I Sanger-metoden anvendes den DNA-streng, der skal analyseres, som en skabelon, og DNA-polymerase anvendes i en PCR-reaktion til at generere gratis tråde ved anvendelse af primere.
Fire forskellige PCR-reaktionsblandinger fremstilles, hver indeholdende en vis procentdel af dideoxynucleosidtriphosphat (ddNTP) -analoger til en af de fire nukleotider (ATP, CTP, GTP eller TTP). Syntese af den nye DNA-streng fortsætter, indtil en af disse analoger er inkorporeret, på hvilket tidspunkt strengen for tidligt trunkeres.
Hver PCR-reaktion vil ende med at indeholde en blanding af forskellige længder af DNA-tråde, som alle ender med nukleotidet, der var dideoxy-mærket for den reaktion. Gelelektroforese anvendes derefter til at adskille strengene af de fire reaktioner i fire separate baner og bestemme sekvensen af den originale skabelon baseret på hvilke længder af tråde der slutter med hvilket nukleotid.
I den automatiserede Sanger-reaktion anvendes primere, der er mærket med fire forskellige farvede fluorescerende mærker. PCR-reaktioner, i nærværelse af de forskellige dideoxy nucleotider, udføres som beskrevet ovenfor. Imidlertid kombineres de fire reaktionsblandinger derefter og påføres på en enkelt gelbane. Farven på hvert fragment detekteres ved hjælp af en laserstråle, og informationen opsamles af en computer, som genererer kromatogrammer, der viser toppe for hver farve, hvorfra template-DNA-sekvensen kan bestemmes.
Typisk er den automatiserede sekventeringsmetode kun nøjagtig for sekvenser op til maksimalt ca. 700-800 basepar i længden. Imidlertid er det muligt at opnå fuld sekvenser af større gener og faktisk hele genomer ved anvendelse af trinvise metoder såsom Primer Walking og Shotgun-sekventering.
I Primer Walking bliver en brugbar del af et større gen sekventeret ved anvendelse af Sanger-metoden. Nye primere genereres ud fra et pålideligt segment af sekvensen og anvendes til at fortsætte sekventering af den del af genet, der var uden for rækkevidden af de oprindelige reaktioner.
Shotgun-sekventering involverer tilfældigt at skære DNA-segmentet af interesse i mere egnede (håndterbare) størrelsesfragmenter, sekventering hvert fragment og arrangering af stykkerne baseret på overlappende sekvenser. Denne teknik er blevet lettere ved anvendelse af computersoftware til at arrangere de overlappende stykker.